淀粉磷酸化酶(SP)測(cè)試盒

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測(cè)定意義：
淀粉磷酸化酶（Starch Phosphorylase，SP）是淀粉代謝過(guò)程可逆反應(yīng)酶，既可催化淀粉的合成，也可催化淀粉的分解。
在高等植物中，淀粉磷酸化酶（合成方向）主要存在于質(zhì)體中，負(fù)責(zé)延長(zhǎng)淀粉的 α-1,4- 葡萄糖鏈的非還原末端；淀粉磷酸化酶（分解方向）主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，催化淀粉中的 α-1,4-糖苷鍵磷酸解產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，負(fù)責(zé)葡萄糖鏈的磷酸解，是淀粉代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶。
在植物體中，淀粉磷酸化酶分解方向的底物無(wú)機(jī)磷濃度比合成方向的底物葡萄糖-1-磷酸濃度幾乎高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，一般認(rèn)為淀粉磷酸化酶只催化淀粉的分解，因此，分解方向的淀粉磷酸化酶具有重要測(cè)定意義。

操作流程：

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3. 樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加。

4. 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

優(yōu)點(diǎn)如下:

1、快速簡(jiǎn)便:操作時(shí)間短,48-50T,可測(cè)40例樣本左右,96-100T,可測(cè)80例樣本左右;

2、取樣量微:常規(guī)操作取樣量50l, 酶標(biāo)儀操作僅需5l即可檢測(cè),部分試劑盒取樣多少請(qǐng);

3、穩(wěn)定性好:試劑盒2~8℃存放3個(gè)月有效;

4、再現(xiàn)性好:20倍稀釋線性仍然良好;

5、回收試驗(yàn): X =99%;

6、受外界影響因素小:干擾因素少,重復(fù)性強(qiáng);

7、測(cè)試面廣:可測(cè)動(dòng)物血清(漿)、組織、各種體液、灌流液、各種培養(yǎng)細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液等,部分試劑盒適用于檢測(cè)植物,歡迎

儀器:

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀/生化分析儀(比色測(cè)定波長(zhǎng)為550nm)

2、恒溫水浴箱或氣浴箱 (孵育溫度為37℃)

3、臺(tái)式離心機(jī)

4、漩渦混勻器

5、微量移液器

使用須知:

(1)請(qǐng)參照相關(guān)法規(guī)、文獻(xiàn)、MSDs等信息,理解并掌握好試劑的特性,再進(jìn)行安全操作。

(2)通常購(gòu)買(mǎi)試劑時(shí)一定要想到--次性用完。若估算不足有剩余的話，更加注意其他保管和管理。

(3)萬(wàn)一-試劑操作者并非專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員。必須在專(zhuān)業(yè)人士的指導(dǎo)監(jiān)督下進(jìn)行操作。對(duì)于使用后的廢棄物,不要或者舊的試劑，應(yīng)按照相關(guān)法律法規(guī)正當(dāng)處理。

(4)購(gòu)買(mǎi)后，請(qǐng)務(wù)必確認(rèn)標(biāo)簽上的注意事項(xiàng);做好預(yù)防顛倒,摔壞的措施和管理體制;在使用前再次確認(rèn)標(biāo)簽上的注意事項(xiàng)，做好必要的安全對(duì)策;對(duì)沒(méi)有標(biāo)明其危害特性、有害特性的，也要慎重地進(jìn)行操作;必須帶好防護(hù)用具，小心翼翼進(jìn)行操作。

生化試劑的種類(lèi)與等級(jí)說(shuō)明:

(1)免疫試劑包括抗體及抗血清、正常血清及補(bǔ)體、抗原、免疫組織化學(xué)研究用試劑、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑、細(xì)胞分離試劑、凝膠內(nèi)擴(kuò)散法及電泳試劑等。

(2)基因工程用試劑包括基因表達(dá)與基因重組、人工合成蛋白、激素、核酸合成試劑、內(nèi)切酶等。

(3)誘變劑和主要供測(cè)定工作場(chǎng)所與生活環(huán)境中的毒物質(zhì)的致癌性與化學(xué)毒物的致突變性。

(4)工業(yè)用化學(xué)品包括試制開(kāi)發(fā)的工業(yè)用化學(xué)品,有四千種以上,還在不斷增加。

樣本收集與前處理:

血清(漿)可直接測(cè)定。

紅細(xì)胞:需按照試劑盒中說(shuō)明書(shū)上紅細(xì)胞的測(cè)定方法進(jìn)行提取后測(cè)定。

動(dòng)物組織樣本:可用生理鹽水按重量體積比制備成組織勻漿液,離心取上清測(cè)定。

培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌、植物組織:常用PBS作為勻漿介質(zhì)破碎后離心取上清測(cè)定。

具體的樣本前處理:參考我們隨貨發(fā)送的《實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》以及試劑盒中詳細(xì)說(shuō)明書(shū)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷我有妙招:

1、定量測(cè)定結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中待測(cè)物的含量。

2、以樣品孔的OD值大于陰性對(duì)照OD值+2~3SD,作為陽(yáng)性結(jié)果的閾值。

3、以P/N值(陽(yáng)性孔OD值/陰性孔OD值)大于或等于2.1為陽(yáng)性,P/N值小于2.1,但大于1.5為可疑,P/N小于1.5為陰性。

4、ELISA試劑盒目測(cè)定性法:加入底物經(jīng)酶解和終止反應(yīng)后,肉眼觀察陽(yáng)性孔顏色明顯深于(競(jìng)爭(zhēng)法則淺于)陰性對(duì)照,與陰性對(duì)照的顏色接近者,判定為陰性。

為了達(dá)到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,取用試劑時(shí)應(yīng)遵守以下規(guī)則,以保證試劑不受污染和不變質(zhì):

(1)試劑不能與手接觸。

(2)要用潔凈的藥勺,量筒或滴管取用試劑,*不準(zhǔn)用同一種工具同時(shí)連續(xù)取用多種試劑。取完一種試劑后,應(yīng)將工具洗凈(藥勺要擦干)后,方可取用另一種試劑。

(3)試劑取用后一定要將瓶塞蓋緊,不可放錯(cuò)瓶蓋和滴管,絕不允許張冠李戴,用完后將瓶放回原處。

(4)已取出的試劑不能再放回原試劑瓶?jī)?nèi)。

另外取用試劑時(shí)應(yīng)本著節(jié)約精神,盡可能少用,這樣既便于操作和仔細(xì)觀察現(xiàn)象,又能得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

淀粉磷酸化酶(SP)測(cè)試盒